作业帮细胞培养冷冻的步骤
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/04 02:41:01
细胞培养冷冻的步骤
细胞培养冷冻的步骤
细胞培养冷冻的步骤
冷冻保存方法一:冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存.
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存.*-20 ℃不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中,惟存活率稍微降低一些.
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 – 90 ％
致密度.
2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二
日测试是否有抗体之产生.
3.注意冷冻保护剂之品质.DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micron
FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小体积
分装,4 oC 避光保存,勿作多次解冻.Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽
灭菌后避光保存.在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性.
4.冷冻保存之细胞浓度：
4.1.normal human fibroblast:3 x 106 cells/ml
4.2.hybridoma:3 x 106 cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma 会因冷冻
浓度太高而在解冻24 小时后死去.
4.3.adherent tumor lines:7 x 106,依细胞种类而异.Adenocarcinoma 解冻后须
较高之浓度,而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml.
4.4.other suspensions:10 x 106 cells/ml,human lymphocyte 须至少5 x 106
cells/ml.
5.冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保
存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败.
6.冷冻方法：
6.1.传统方法:4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)
---> 液氮槽vapor phase 长期储存.
6.2.程序降温：利用等速降温机以–1 -3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC,
放在液氮槽vapor phase 长期储存.适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存.